中药生精冲剂对生精障碍小鼠治疗作用的实验研究

Experimental Study on the Effect of Soluble Granule of Chinese-medicine Shengjing 0n Spermatogenesis Disturbance of Mice

XU Lei，WANG Rui，ZHANG Wei-xing，WU Yu-feng，郑州大学第一附属医院男科王瑞

SHI Jian-hua，ZHANG Yue-xi

Department of Urology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou Henan 450052

Abstract： Objective:To observe the effect of Chinese medicine soluble granule of Shengjing on spermatogenesis disturbance of mice． Methods:Kunming mice were used and randomly divided into 4 groups. Spermatogenesis disturbance models were obtained by being intraperitoneally injected cyclophosphamide. Model group：Kunming mice without given any treatment after the models were formed； Positive control group：clomiphene was used after the models were formed(21．6mg/kg·d,15d)； Chinese medicine group：soluble granule of Shengjing was administered after the models were formed(16g／kg·d，15d)． Testis weight was measured, blood was collected and the follicle stimulating hormone and the luteinizing hormone and the testosterone level were measured by radioimmunoassay．Microscopy was applied in this study． Results:The testosterone level and the testis weight of the Chinese medicine group obviously increased, and the follicle stimulating hormone and the luteinizing hormone and the testosterone level obviously decreased, compared with the model group (P﹤O.05). The number of the sperm cells on the seminiferous tubules and the spermatozoon in the lumina of the seminiferous tubules of the Chinese medicine group was increased compared with the model group.  Conclusion:The Chinese medicine soluble granule of Shengjing is effective for the spermatogenesis disturbance of mice．

Key words:soluble Granule of Shengjing；spermatogenesis disturbance；mice；male sterility；testis

据统计，70%以上的男性不育病因及发病机制不清，只表现为少精或弱精等精子质量异常[1]。男性不育大多涉及多种因素，因此其治疗有其复杂性。环磷酰胺是临床上常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，对睾丸有明显的损伤作用，导致无精子症或少精子症，造成不育。利用环磷酰胺致精子生成障碍模型，进行不育症的实验研究，已见报道[2]。而在少精子症的治疗中，单纯的西药治疗效果并不明显，而一些中药方剂的使用可以明显提高疗效，我院采用协定处方生精冲剂治疗少精子症多年，取得了很好的临床效果，本实验通过观察中药生精冲剂对实验性小鼠少精症的疗效，进一步探讨其作用机理，以更好的应用于临床上的少精子症的治疗。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物  普通级健康青春期昆明种雄性小鼠46只，1月龄，体重20-30g，购于河南省实验动物中心。

1.1.2 实验药物及试剂  生精冲剂的协定处方：紫河车、黄芪、枸杞子、菟丝子、仙灵脾、龟甲、砂仁、丹参，由郑州大学第一附属医院提供；生产流程：将中药常温下清洗之后，70℃下4h烘干，混合研磨成粉，过200目筛，包装后经Co60辐射灭菌。枸橼酸氯米芬胶囊（克罗米芬），由上海衡山药业有限公司生产，生产批号：060401；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生产批号：061016；血清FSH、T、LH放射免疫试剂盒由天津九鼎生物制品有限公司提供。

1.2  方法

1.2.1 动物分组  实验小鼠适应性喂养5d后，把46只雄性昆明小鼠随机分为4组，依次为：A组（正常组）10只，B组（模型组），C组（对照组），D组（中药组）,每组12只。

1.2.2 造模方法  除正常组外，每只小鼠予腹腔注射环磷酰胺（配制成0.1%注射液）75mg/kg·d，连续5d。再喂养15d,造成生精障碍模型[3]。

1.2.3 给药方法  造模次日，根据人和动物之间用药剂量的换算和动物与动物之间用药剂量的换算，开始对中药组小鼠给予灌胃生精冲剂 (16g/kg·d)，对照组给予灌胃克罗米芬 (21.6mg/kg·d)[4]，模型组和正常组灌胃等量生理盐水,连续15d。

1.3 观察指标

1.3.1一般体征观察   观察小鼠的精神，活动情况，体毛和体重变化等。

1.3.2生殖激素测定   末次给药24h后，将全部小鼠断头取血，分离血清，用放射免疫法测血清睾酮值（T）和黄体生成素值（LH）和卵泡刺激素（FSH）。

1.3.3 睾丸重量的测量    取各组小鼠双侧睾丸，用冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸滤干，电子天平称重。计算平均睾丸重量，并计算睾丸指数。睾丸指数(g／kg)＝睾丸重量(g)／实验后体重(kg)。

1.3.4 睾丸组织形态的检测   取各组小鼠左侧睾丸组织，用Bouin's固定液固定后石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察生精小管形态和精子发生状态。包括曲细精管、精子、生殖细胞层次分析。

1.4  统计分析  结果用应用SPSS11.0软件进行统计处理，所有数据均用( ±s)表示，各组间比较用方差分析，两组之间比较用q检验，以P﹤0.05为差异有显著性。

2  结果

2.1 一般体征变化   各造模动物于开始腹腔注射环磷酰胺第3d起，逐渐出现精神萎靡、少动；恶寒蜷缩；体毛稀疏脱落、无光泽；消瘦、体重增长不明显，甚至下降。从第2周到第3周,体重几乎没有明显变化，模型组和对照组各死亡2只小鼠，中药组死亡1只小鼠；而正常组小鼠体重则日渐增长。造模完成后，中药组动物给予生精冲剂治疗后精神体征明显好转，模型组和对照组改善不明显。

2.2 血清FSH、LH和T测定的结果   结果见表1，可见中药组FSH和LH与正常组相比无显著差异(P﹥0.O5)，与模型组、对照组相比显著降低(P﹤0.O5)；中药组T水平显著高于模型组和对照组 (P﹤0.O5)。

表1 各组血清FSH、LH、T测定结果( )

Table 1.Results of the serum FSH,LH and T measurement( )

Group

n

FSH（mIU/ml）

LH（mIU/ml)

T（nmol/L)

A

10

2.789±0.442△*

3.077±0.463△*

7.178±0.340△*

B

10

5.428±0.719＃*

5.155±0.460＃

6.231±0.317＃

C

10

6.250±0.691＃

5.485±0.541＃

6.293±0.286＃

D

11

2.947±0.587△*

3.254±0.492△*

7.046±0.291△*

与A组比较,#：P﹤0.05；与B组比较,△：P﹤0.05；与C组比较,﹡：P﹤0.05

Compared with A,#:P﹤0.05；compared with B,△:P﹤0.05；Compared with C,﹡:P﹤0.05

2.3 睾丸组织形态学观察  正常组：光镜下睾丸呈正常组织形态，动静脉血管正常；曲细精管的生精细胞层数多，各级生精上皮细胞层次明显，排列紧密，管腔内充满精子；基膜薄，间质细胞成群分布，发育正常。

模型组：曲细精管多退化、萎缩，管壁生精上皮变薄，生精细胞层数减少，排列紊乱，精子细胞较少，腔内精子少见，睾丸曲细精管间隙明显增大，精曲小管之间的结缔组织增多，间质细胞数量亦明显减少，间质血管壁增厚，且见有白细胞浸润的现象。

对照组：大部分曲细精管的生殖细胞层次较紊乱，细胞层次较少，精子细胞较模型组无明显变化，管腔内精子少见，间质细胞数量较少，间质细胞损伤较重。

中药组：大部分曲细精管的各级生精上皮细胞层次较明显，排列较规整，管腔内可见较多成熟精子生成，也存在有少数不同程度萎缩变性的曲细精管；间质细胞数量较模型组明显增多。

图1　正常组睾丸组织切片(HE染色，×400)

Figure 1. The tissue slice of the testis in the normal group (HE，×400)

图2　模型组睾丸组织切片(HE染色，×400)

Figure 2. The tissue slice of the testis in the model group (HE，×400)

图3　对照组睾丸组织切片(HE染色，×400)

Figure 3. The tissue slice of the testis in the positive control group (HE，×400)

图4　中药组睾丸组织切片(HE染色，×400)

Figure 4. The tissue slice of the testis in the Chinese medicine (HE，×400)