通过计算机辅助药物设计开发针对血栓的新药候选

通过计算机辅助药物设计开发针对血栓的新药候选

米国范德比尔特大学 (Vanderbilt University) 的一组研究人员发明了一系列新的候选药物，用于对抗一种参与血栓形成的难以靶向的受体。

这项研究由化学研究教授 Jens Meiler、Warren 神经科学药物发现中心执行董事 Craig Lindsley、心血管研究和药理学教授 Aileen M. Lange 和 Annie Mary Lyle 的心血管研究教授和药理学教授 Heidi ham 的实验室领导，于2024年3月在线 (4月正式见刊) 发表于《ACS药理学和转化科学》 (ACS Pharmacology and Translational Science) 上，引发国际关注。

米国范德比尔特大学 (Vanderbilt University)

阻碍血液流动的血块(血栓)会折磨任何人，可以在静脉中形成，如肺栓塞，或在动脉中形成，如心脏病或中风。虽然血栓并不一定是致命的，但在大流行爆发之前，仅米国每年就有10万到30万人死于血栓，但这个数字很可能在以后有所增加。根据英国2022年的一项全人口研究，COVID-19感染会增加一个人在感染后立即以及长达49周的血液血栓相关问题的风险。

血栓的风险会因某些危险因素而加重，但可以通过抗血小板药物等药物减轻，但这些药物会产生不良的副作用。针对血小板的新方法涉及蛋白酶激活受体4，血小板是血栓形成的关键；来自Vanderbilt实验室等机构的最新数据表明，PAR4也可能是治疗炎症性疾病(如肾损伤和阿尔茨海默病)的一个可行的药物靶点。

然而，尽管PAR4具有明显的吸引力，但它很难成为目标。PAR4是一种细胞表面受体，当一种叫做凝血酶的蛋白酶裂解PAR4的尾部时，它就会被激活，从而暴露出一条与PAR4的其他部分相互作用的“新”尾部(称为束缚配体)。由于受体的配体依附于受体本身，因此很难创造出一种能够超越束缚配体并抑制PAR4的PAR4抑制剂。

TIPS: tethered ligand, 束缚配体。被受体掩遮的配体。如凝血酶受体的真正配体是在受体内部。当表观配体——凝血酶与受体结合时就将受体降解，而被暴露出来束缚配体就将受体激活并发挥生理作用。

前Meiler实验室研究生、论文第一作者 Shannon Smith 指出：

主要的技术创新来自于计算机辅助药物设计中超大库筛选 (ultra-large library screening) 的应用，这种方法允许我们在硅中测试数十亿类药物分子的生物活性。

作者利用计算机模拟将1.29亿个化合物“对接”到PAR4的计算机模型上。在筛选中发现的新拮抗剂，然后在Lindsley实验室通过药物化学进行改进，并测试对受体的生物抑制作用。

虽然使用这种类型的筛选并不新奇，但这种筛选从未对没有已知结构的蛋白质进行过——只对具有已知晶体结构的蛋白质进行过。

Smith 指出：

由于当时没有 PAR4 的实验结构，我们使用了 PAR4 的模型，仍然能够成功地开发出一系列具有生物活性的化合物。

这为基于结构的计算机辅助药物设计提供了机会，可以在没有实验结构的情况下设计大量靶点。

筛选得到的 PAR4 配体构成了一个新的系列，与早期的 PAR4 配体家族相比具有不同的药理作用。作者将利用新的系列进一步探索 PAR4 的结构和功能，以及配体本身如何与受体相互作用和抑制。

最终，他们希望他们的工作能向其他研究人员表明 PAR4 和其他类似的受体并不像他们最初想的那样难以定位。

米国范德比尔特大学医学院 (Vanderbilt University School of Medicine)

Hamm 指出：

阻断 PAR4 活性的能力可能为一些慢性疾病提供治疗方法，包括心脏病和中风，以及像阿尔茨海默病这样的炎症状态。这项突破非常令人兴奋。

原文图1：PAR4激活机制。

原文图2：先前鉴定的PAR4拮抗剂。(A)红框遵循3到4和5吲哚系列的主导优化；淡蓝色表示从HTS的BMS-3(2)和BMS-986120(1)开始的BMS咪唑二唑系列临床试验;；紫色表示吲哚和咪唑噻二唑系列嵌合序列(6)。(B) BMS-3的预测结合模式(绿色)。与实验确定的绑定模式比较：vorapaxar (PAR1, PDB ID: 3vw7，青色)，AZ3451 (PAR2, PDB ID: 5NDZ，黄色)，AZ8838 (PAR2, PDB ID: 5NDD, 品红)。

附：背景信息

PAR4作为治疗靶点

凝血酶是血小板的主要激活因子，通过细胞外结构域的分裂激活蛋白酶激活的受体PAR1或PAR4，显示出束缚配体(TL)。

PAR1首先被低浓度的凝血酶激活，但PAR1信号是短暂的。止血启动需要PAR1的激活，但由于PAR1介导的血小板激活在其表面产生血小板凝血酶原，局部凝血酶浓度增加。

当局部凝血酶浓度高到足以激活PAR4时，凝血酶信号由PAR4主导。PAR4信号比PAR1更持久，并驱动更多的凝血酶生成、纤维蛋白原裂解为纤维蛋白和微颗粒形成。

虽然PAR4在激活血小板方面最为著名，但PAR4也在多种细胞类型上表达，炎症环境下的PAR4表达水平高于对照条件。PAR4敲除小鼠研究表明，PAR4在中性粒细胞归巢和入侵血管损伤部位中发挥作用。

PAR4参与了心肌梗死和中风动物模型缺血再灌注损伤后的组织损伤，以及炎症性肠病、肺炎症和纤维化、关节炎的组织损伤。

PAR1与凝血酶的亲和力高于PAR4，但尽管早期临床前景良好，但在三期临床试验中，将vorapaxar (唯一已获许可的PAR1拮抗剂) 添加到标准护理中未能满足其在急性冠脉综合征患者中的主要疗效结果，并与大出血过多，特别是颅内出血有关。

因此，人们开始关注PAR4作为潜在的凝血酶受体治疗靶点。Bristol-Myers-Squibb (BMS)开发了PAR4拮抗剂BMS-986120(1)和BMS-986141作为抗血栓药物，对PAR4的凝血酶激活具有较高的效力和特异性。

PAR4拮抗剂被假设比PAR1拮抗剂有更低的出血风险，因为PAR4比PAR14在血小板活化过程的后期起作用。重要的是，在食蟹猴动脉血栓形成模型中，BMS-986120(1)显示了有效和高效的抗血栓活性。

在同一非人灵长类动物模型中，与氯吡格雷相比，BMS-986120(1)也显示出低出血倾向和明显更宽的治疗窗口。在一期人体临床试验中，BMS-986120(1)和BMS-986141在健康受试者中广泛存在安全性和良好耐受性。

然而，目前BMS化合物尚未在临床开发中取得进一步进展，最终需要更大规模的临床试验来确定其安全性。

靶向PAR4

与大多数其他GPCRs不同，PARs不能通过与可溶性配体结合而激活。相反，它们是由蛋白酶触发的，蛋白酶会切割它们的一部分N端，暴露出一个新的N端，称之为“束缚配体”，它在分子内与受体结合，激活受体并诱导信号转导。

实验表明，PAR4既可以被天然的蛋白酶凝血酶裂解事件激活，也可以被合成的模拟束缚配体的可溶性激动剂肽(“PAR4- AP”)激活。

PARs的这种不寻常的作用机制对小分子拮抗剂的开发提出了重大挑战。原生束缚配体激活物是PAR新切割的N端，有效地以高局部浓度存在于PAR结合位点周围(估计高达0.4 mM)，使得这些受体难以被抑制。

几个研究小组成功地抑制了激动剂肽PAR4的激活，包括吲哚骨架、吲哚衍生物和CNS外显系列；然而，这些化合物并不能有力地抑制PAR4的生理相关凝血酶激活。Bristol-Myers-Squibb发布了一项专利，描述了一系列有效的生物可利用的PAR4拮抗剂(WO2013163244)。

BMS活动的初始打击 (BMS-3 (2)) 包含咪唑噻二唑基团，是一种选择性和有效的PAR4凝血酶拮抗剂。上述研究团队合成了这种作为工具化合物，"BMS-3"(2)。咪唑噻二唑与吲哚嵌合对γ-凝血酶具有弱拮抗作用(IC50 = 4.35 μM)。具体来说，将2作为最小药效团，对该分子进行系统截断，发现抑制模式从非竞争性转变为竞争性。

目前还没有实验确定PAR4的结构：然而，利用PAR4的同源模型结合突变和已知拮抗剂进行的广泛的硅建模研究，使上述团队提出了BMS-3的结合模式。该研究从结构上探索了“按需制造”的化学空间，以寻找可以延伸到拮抗剂结合袋中的新化合物。