尖锐湿疣的实验室检查方法

    大部分尖锐湿疣肉眼即可诊断，但也有一部分临床上一时不能确诊，要靠实验室或者其他试剂才能诊断，如与扁平湿疣鉴别，就需要做梅毒血清试验。下面介绍几种常用的检查

 

一、醋酸白试验中山大学附属第六医院皮肤科陈建浩
　　醋酸白试验在临床上主要用来检则亚临床的HPV感染，特别对女性宫颈亚临床HPV感染诊断有一定意义。由于该法敏感性较好，且操作简单，所以适用于一般的临床和流行病学研究中，如果醋酸白试验联同阴道镜检查和组织病理学方法一同评价，将较大地提高阳性预告值。

　　不少资料证实亚临床HPV感染远较临床明显的病变为多，只有用特殊的方法才能检测到。亚临床的HPV感染最初在子宫颈发现，而后又在女性外阴、男性的阴茎以及肛周发现类似的损害。亚临床的HPV感染可以单独存在或肉眼可见的疣并存。近年来不少的研究已证实了HPV感染与肿瘤的关系，所以亚临床的HPV感染也愈来愈引起人们的重视。目前实验室检测HPV感染的方法较多，常用的有免疫学方法、脱氧核糖核酸分子杂交技术和多聚酶链式反应等。目前尚无血清学试验，HPV也不能培养。虽然上述实验方法具有一定的敏感性和特异性，但由于需要较复杂的实验设备和技术，所以难以在一般的临床和流行病学中应用。近年来一些学者建议利用醋酸能使HPV感染区变白的特性去检测亚临床的HPV感染，认为该法如果与放大技术联合应用，将是一种较为简易、适用且较准确的方法。该法最早用来确定女性宫颈HPV感染的可疑区，而最近一些研究的兴趣已转向检测患有生殖器湿疣损害或上皮内增生物妇女的男性性伴的亚临床损害。近期的一项调查表明，有尖锐湿疣组织学表现妇女的51例男性性伴中，有72%用5%醋酸液涂布在正常阴茎表面皮肤后，用阴道镜检查确定为无症状的HPV感染。

方法与原理
　　用棉拭子蘸3%～5%的醋酸液涂于可疑的受损皮肤上，一般变白(又称醋酸白-acetonhite)结果在1分钟后就可以观察到。但在女性的外阴部，醋酸白现象需在3～5分钟后才可观察。男性受检时，应在阴茎和阴囊上用3%～5%醋酸浸透的纱布覆盖3～5分钟，然后用10～16倍放大镜观察外部皮肤，寻找隐伏的湿疣或醋酸变白区。为了有把握地使肛周病损变白，可能需要更长的时间，一般为15分钟。由于使用放大技术特别是同时使用阴道镜观察，使醋酸白试验得到了改进，用阴道镜放大后使醋酸白部位变得更加清晰明显，但大多数情况下，使用简单的放大镜就足够的。

　　醋酸白试验使不明显的疣变得肉眼可见，其作用机制尚未明确。一种理论认为，变白是蛋白凝固的结果，而这种蛋白质反映了HPV感染上皮的不正常细胞和细胞过多的特征。另一种理论假设HPV感染上皮与正常的未感染上皮的角蛋白不同，只有前者才能被醋酸致白。

在阴道镜下的表现
　　在使用醋酸后，宫颈亚临床HPV感染的阴道镜特点为发亮、雪白的损害，其边缘为不规则的锯齿状、角状或羽毛状。在移行区以外有扩散的卫星状病灶，同时可见到毛细血管图像，通常由口径相同的血管组成，疏松、紊乱的排列往往象一个水平面上的筛孔，扩张的毛细血管袢也可能垂直地伸向表面，以相同的管径遍及整个病损部位。如由于醋酸引起小血管收缩，血管图像不够明显时，可在放大镜上加用绿色滤片，使图像更为清晰。

　　象宫颈阴道镜表现一样，男性生殖器HPV感染的醋酸变白区在阴道镜下为明亮、雪白色和有光泽。值得注意的是，男性亚临床HPV感染有22%发生在阴囊处，因为很少注意到此解剖区可能是HPV的庇护所，所以该处可能是传播HPV的重要部位。Wikstrom根据放大镜下的表现不同，将男性生殖器醋酸白的表现分为三个类型：① 典型的：可见易区分的、边缘稍隆起的损害以及与上皮凹陷有关或无关的点状中心毛细血管；② 明显的、可见易区分的边缘稍隆起的损害，但缺乏明显的点状毛细血管；③ 不典型的：损害表现为高低不平的边缘，缺乏点状毛细血管。

临床应用
　　Wikstrom的调查表明，醋酸白试验典型和明显的HPV感染有62%与组织病理的结果一致。而不典型表现仅11%一致。如以组织病理的结果为基础，醋酸白试验的敏感性为85%，特异性为12%。如以核酸印迹法和原位杂交技术为基础，则敏感性为85%，特异性11%，由于醋酸白试验有一定的敏感性，且方法简单，不需要复杂的仪器设备，所以适用于一般的临床和流行病学研究。

　　醋酸白试验主要用在临床上检测亚临床的HPV感染。由于女性宫颈HPV感染大多是亚临床的，所以只有使用了醋酸才看得见。而在女性的外阴尖锐湿疣是常见的，但大多同时合并有亚临床的感染，所以在外阴部位使用醋酸白试验检测亚临床的HPV感染可以确定尖锐湿疣复发的来源。其次可以认识以前尚无法解释的前庭瘙痒、灼热感和性交不适等使病人非常苦恼的疾患，亚临床的HPV感染可能是其原因之一。后一种情况一般病程较长，可误诊为念珠菌感染，长期无效的治疗只会加重病情。

　　男性生殖器亚临床HPV感染可引起肉眼不易查见的小而无蒂的损害，特别是丘疹和斑片状损害，即使非常细致的检查也难以发现，而使用醋酸后，损害可表现为境界清楚的"醋酸变白区"。对于高危的男性人群进行亚临床HPV感染筛查，对于预防女性宫颈癌有重要意义。有资料表明，临床不明显的HPV感染的男性可用为女性潜在致癌的HPV的来源。伦敦的一项调查从组织学上诊断为宫颈上皮内肿瘤(CIN Ⅲ级)妇女的75名男性性伴中，发现有49名(65%)从组织学上证实有阴茎HPV感染，16%出现临床可见的损害，49%用醋酸白试验和阴道镜证实为亚临床的HPV感染。

　　亚临床HPV感染是常见的，用醋酸白试验发现一些病例，原则上也应进行治疗，但实际上很难办到。目前大多数临床医生对肉眼可见的生殖器肛门疣只是设法除掉疣体，而不注意找出亚临床的损害，对那些经常复发的病人和筛查临床外观正常的病人性侣时，才作醋酸白试验。

 

二、免疫组织学检查

　　常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP），显示湿疣内的病毒蛋白，以证明疣损害中有病毒抗原。HPV蛋白阳性时，尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应。

三、组织化学检查

　　取少量病损组织制成涂片，用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原，则抗原抗体结合。在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成红色。此法特异性强且较迅速，对诊断有帮助。

四、病理检查

    主要为角化不全，棘层高度肥厚，乳头瘤样增生，表皮突增厚，延长，其增生程度可似假性上皮瘤样。刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂、颇似癌变。但细胞排列规则，且增生上皮和真皮之间界限清楚。其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成。此种空泡细胞较正常大，胞浆着色淡、中央有大而圆，深嗜碱性的核。通常真皮水肿、毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润。Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣，表皮极度向下生长，代替了其下面的组织、易与鳞状细胞相混，故须多次活检。若有缓慢发展之倾向， 则为一种低度恶变的过程，即所谓疣状癌。

五、基因诊断

　　迄今，HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为HPV检测开辟了新途径。

　　（一）标本的采集及处理

　　1.标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检查的同时，将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS离心（3000g，10min）洗涤2次，沉积细胞重悬于1mlPBS中，取0.5ml细胞悬液抽提DNA。

　　2.标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下处理过夜；且等体积酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60μl含RNA酶（100μg/ml）的TE液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA）溶解DNA，37℃温育30min。

　　（二）PCR扩增

1. 引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L），每区含一系列开放读码框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有保守序列。Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1，该引物与HPV 6、11、16、18及33型有互补序列，也可扩增其它型HPV。

　　2.PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP贮备液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR缓冲液（500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5），100μmol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。

　　3.PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液，用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。

　　（1）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。

　　（2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。

　　（3）加入80-100μl石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前，PCR试剂已商品化，反应体积为25μl。使用时只加入标本DNA即可。

　　（4）将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min。

　　4.每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如Caski、HeLa）DNA为阳性对照，以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。

（三）扩增产物的检测和分析

　　1. 凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。

　　2. 核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。

　　按照标准方法制32P ATP标记的寡核苷酸探针，需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h，随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC、0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜，除去多余探针。然后进行洗膜，其条件依所用探针而异：公用混合探针，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探针，56-57℃下10 min，并换液重洗1次；MY14及WD74探针，58-59℃下10min，亦换液重洗1次。

　　用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPV DNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPV DNA。

　　鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。